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葡萄基因转导研究进展

时间:2008-09-16 |来源:中国葡萄销售网 收集整理|点击:


 1  转基因技术与常规育种手段的关系
    与常规育种技术相比,转基因育种虽然在技术上十分复杂,要求也很高,但也有常规育种不可企及的优点,这就是转基因育种中基因的利用不受种间隔离的限制,可以利用生物界的所有有用基因,甚至人工合成的基因,利用转基因育种一方面可以大大拓宽有用基因的来源,另一方面可大大提高选择效率,加快育种进程。
    2  葡萄基因转导途径
    葡萄上应用较多的有农杆菌介导法和基因枪法两种转导途径。
    2.1  农杆菌介导法
    这是植物基因工程中应用最多、效果最理想的方法。农杆菌可以通过伤口感染受伤的双子叶植物,且其Ti质粒的一段DNA可转移进植物细胞,稳定地保留在植物细胞染色体中,最终能遗传给子代。此法主要采用Ti质粒衍生载体进行原生质体共培养、植物组织共培养和原生质体融合来实现基因转移。
    2.1.1  根癌农杆菌介导的遗传转化  葡萄通过茎段、上胚轴等,将GUS,NPTⅡ外源基因转入,形成了基因转化植株。一些学者在20世纪80年代作了一些探索,获得转基因愈伤组织,但未获得再生植株。用根癌农杆菌转化葡萄,表达了抗卡那霉素和合成β-葡萄糖甘酸酶基因。黄学森和Mullins用改进的Ti质粒作载体,感染葡萄生长点碎片后,也表达了抗卡那霉素基因及合成胴脂碱基因。直到Mullins等采用由沙地葡萄花粉诱导的体细胞胚、下胚轴片段与携带GUS、NptⅡ基因的农杆菌共培养,才首次获得了转基因植株。近年来,采用此法已成功地导入了一些目的基因。Gall等通过农杆菌介导,将GCMV的CP基因导入葡萄砧木110R花粉诱导的体细胞胚中,得到再生植株。Mauro等将砧木品种41B和S04以及一个欧洲葡萄的花粉胚性细胞悬浮液与GFLV-CP基因的农杆菌共培养,获得了转墓因植株。Krastanova等用沙地葡萄和110R花粉的胚性愈伤组织和成熟胚的下胚轴碎片与农杆菌系LBA4404共培养,将GFLV-FB的CP基因导入,得到再生植株。张克忠等以胚性愈伤组织作为农杆菌Ti质粒介导转化的材料,首次将Bt杀虫蛋白基因导入葡萄胚性愈伤组织,并通过胚状体发生途径获得转基因植株,证实了农杆菌Ti质粒侵染转化胚性愈伤组织细胞,并通过胚状体再生转基因植株这一途经的可行性,为外源目的基因导入葡萄建立了较为理想的遗传转化体系。Xue等通过农杆菌介导法,以3309、110R等5种砧木的花药诱导的体缅胞胚为试材,获得了转基因植株。Tsvetkov等以无核葡萄未成熟的合子胚和砧木110R与沙地葡萄Rupestris du Lot的叶片组织诱导的胚性培养物和根癌农杆菌共培养,成功地将GFLV与4种抗冻基因导入再生植株体内,并通过Southern检测获得了转基因植株。日本筑波市国立果树科学研究所的科学家Yamamoto等通过农杆菌感染将水稻壳多糖酶基因导入葡萄的体细胞胚,首次育成了可抗真菌病的葡萄。Iocco等用农杆菌与胚性愈伤组织共培养的方法将green fluorescent protein基因转入酿酒葡萄霞多丽进行转基因酿酒葡萄的研究与推广。陈力耕等采用葡萄茎段为外植体建立起高频再生体系,随后建立了农杆菌介导的葡萄主栽品种玫瑰香的稳定遗传转化体系,获得转基因植株,成功地将拟南芥LEAFY基因整合到葡萄染色体DNA上。孙仲序等以葡萄品种鲁贝的花丝为试材,在悬浮细胞再生植株的基础上,通过农杆菌介导转化甜菜碱醛脱氢酶基因而获得了转基因植株。
    2.1.2  发根农杆菌介导的遗传转化  迄今为止,采用发根农杆菌介导的遗传转化途径仅Nakano等用来自叶片的体细胞胚与发根农杆菌共培养,获得了一例转基因植株。据此可知,发根农杆菌是可作为遗传转化的载体的,这是一个非常值得研究的方向。
    2.2  基因枪法
    基因枪法是利用一种仿枪结构的装置,将表面附有外源遗传物质的金属颗粒直接射人受体,其表面吸附的外源DNA也随之进入细胞、受体可以是植物组织也可以是细胞。该方法具有一次处理可使千金细胞转化的优点。
    目前,葡萄通过悬浮细胞将GUS、NPTⅡ外源基因转入而形成基因转化再生植株。葡萄器官发生的解剖学表明,伤口表面易受农杆菌侵染的细胞并未参与再生,这无疑会大大降低转化频率。Herbet用包裹质粒的钨弹轰击葡萄细胞悬浮系,获得了转化的愈伤组织。scorza等就利用两步法转化来提高葡萄的转化率,他们先用1μm金弹轰击由无核白试管叶片产生的体细胞胚,轰击2次后再与农杆菌共培养,提高了转化率。Bouanama等研究认为,基因枪的轰击会对外植体造成创伤,而创伤有利于农杆菌对外植体的侵染。可见,转化方法之间可以相互配合使用,取长补短,应进一步研究和推广。
    3  影响葡萄基因转导的几个因素
    3.1  受体与再生系统
    转基因植株的获得依赖于合适的转化受体及转化细胞的有效再生。合适的转化受体首先要容易再生,要有高效稳定的再生能力。因此,在进行转化之前选择易于再生的外植体建立有效的再生体系是十分必要的。其次,具有再生能力的细胞要对农杆菌敏感且能接触到农杆菌。
    葡萄常用的转化受体主要为合子胚、体胚、胚性愈伤组织、悬浮细胞等(表1)。葡萄不同外植体的转化结果表明,体细胞胚比叶片好,具有很强的接受外源DNA的能力,转化率高,可达13%。葡萄体胚来源于叶片,且通过次生胚起源于单细胞,是较好的转化受体。Martinelli和Mandolino将沙地葡萄叶柄再生的体细胞胚与农杆菌共培养,获得了转基因株;又以沙地葡萄体细胞胚为试材,研究了获得的转基因株体内GUS基因的稳定性,分子检测表明在长期的胚培养过程中,插入基因都没有丢失,Southern检测表明GUS基因的插入率高达92%。
    3.2  转化细胞的筛选和检测
    在进行葡萄转化试验之前,要采用合适的选择标记基因、合适的抗生素及其浓度进行转化体的筛选。葡萄对卡那霉素十分敏感,Mullins等认为恰当的卡那霉素浓度对葡萄转化组织的筛选十分重要,能使转化芽生长而抑制非转化芽。而Martinelli和Mandolino则采用高选择压获得了葡萄的转化植株。
    用抗生素进行筛选,只是获得转基因葡萄的第一步,需要对经筛选初步得到的植株进行检测。检测时需注意两个问题:(1)当几个基因串联导入时,可能会出现基因部分导入或导入基因仅部分表达的现象。(2)葡萄需检测在无选择压下营养繁殖的个体内目的基因是否稳定存在并表达,以防出现嵌合体。因此,要想获得均一的并稳定表达的转基因植株,必须进行长期检测。
    3.3  培养方法与培养条件
    农杆菌介导的转化在转化过程中要合理掌握接菌的数量、时间和共培养的时间,注意解决瞬时表达效率高而随后而来的细菌增殖所导致的外植体不能生长的矛盾。良好的农杆菌和葡萄愈伤组织细胞培养状态是保障转化成功的基础。张克忠等实验表明,当农杆菌培养至菌液OD值为0.8时,农杆菌对植物细胞浸染转化能力比较强。转化处理前的葡萄愈伤组织从B528培养基(B5基本培养基附加0.5mg/L 2,4-D和2.0mg/L 6-BA)转移到分化培养基C(MS基本培养基附加0.5mg/L6-BA)上培养10d,可以明显提高转化效率。
    共培养后的胚性愈伤组织如何及时除菌是一技术难题。张克忠等在对菌液浓度稀释,调整共培养基pH值,控制共培养时间的基础上,采用以下措施对于及时杀灭细菌起了明显效果:(1)头孢霉素和羧苄青霉素配合使用比单独使用其中一种的效果要好。(2)在培养基上放置愈伤组织时要注意扩大接触面积。(3)缩短除菌期间的继代时间,一般采用10d一次。
    农杆菌在感染外植体后或由于抗生素的加入,细胞的生长受到影响,往往要调整培养基的成分促进外植体的再生。Perl等认为杀死农杆菌的抗生素和作为植物选择标记的抗生素都不引起坏死,细胞死亡与氧化物有关,并且随过氧化物浓度的提高而坏死加重,他们发现,加入PVP(聚乙烯砒硌烷酮)和DDT(二硫苏糖醇)等抗氧化剂可以完全抑制坏死,而农杆菌的致病力不受影响。
    4  葡萄基因工程的研究进展及展望
    随着生物技术的飞速发展,人们越来越多地把目光投向具有商业价值的转基因植物。葡萄遗传中已有许多可以利用的目的基因,越来越多的目的基因已被导入。但此工作仍较为困难,迄今为止仅获得了较少的转基因植株。
    展望葡萄的基因工程,未来的研究应集中在以下几个方面:(1)探索高效的再生途径,建立完善稳定的遗传转化体系,这是今后基因转导工作的重点。(2)选择能够对转化细胞进行准确筛选的报告基因,加快葡萄目的基因的分离与克隆,尤其是加快基本身基因的分离。目前,研究较多且成功导入葡萄的目的基因主要为葡萄扇叶病毒的CP基因等,而在抗冻、抗盐碱、无核、品质等其它方面研究较少,这是今后基因转导工作中应该注意的问题。(3)基因产品的安全性给予科学的重视,特别是酿酒品种。(4)葡萄育种尽管在基因转导与再生系统上有了很大的发展,但对于导入外源基因后的植株生长发育状况的研究仍然很少。(5)探索高效的快捷途径。最近,国外一些学者在农作物的转基因育种上,采用直接简便的花粉管通道法,就是利用开花植物授粉后形成的花粉管通道,直接将外源DNA导入来转化尚不具备正常细胞的卵、合子或早期胚胎细胞,实现目的基因的转移,排除了植株再生的障碍,并且转移基因所控制的性状在受体植株中易于稳定,提高了其育种速度。可以相信,若将此法在葡萄上的探索并获得成功的技术体系用于葡萄砧木和特定性状的育种工作中,将有广阔的应用前景。


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